シロイヌナズナの変異原処理 - motosehiroyasu @ ウィキ

Ethyl methane sulfonate (EMS) によるシロイヌナズナの変異原処理　2008/01/15　本瀬宏康

１．シロイヌナズナの種子（約200 mg = 10000 粒＊注１）を50 mlの遠沈管に計りとる。
２．70%エタノール20 ml を加え、ボルテックスする。（室温で1-3分処理）デカントで70%エタノールを捨てる
３．滅菌液（10倍希釈の次亜塩素酸 + 0.1% TX-100）20ml を加え、ボルテックスする。
４．滅菌液に5-10分浸ける。＊注2
５．滅菌水で5回程度洗う。
６．最後に滅菌水10 ml に種子が浸かった状態にする。
７．ドラフト内で、EMSの原液を10 µl加え（終濃度０．１％）、素早くかきまぜる。EMSは比重が重く、沈んでまざりにくいので、よくまぜる。（別容器に0.2％EMS 10 ml を用意して、これに種子懸濁液を加えてまぜてもよい。）
EMSは揮発性で、発ガン性・催奇性があるので、かならずドラフト内で開封・処理する。使用したチップなどは1N NaOH溶液中に廃棄し、中和する。また、下にキムタオルやRI用のシートを敷き、手袋をして行う。下敷きや手袋もNaOH溶液中に廃棄する。
８．１６時間程度、室温で処理する。（＊注３）
９．滅菌水で１０回洗う。4、５回目は、30分程度浸けて、種子中のEMS をしみ出させる。廃液は1N NaOH溶液中に廃棄し、中和する。
１０．だめ押しで、数回洗う。
１１．4度で2日程度処理し、プレートや土にまく注4。
１２．M1植物100-500個体程度から、M2種子をまとめて回収する。
各M2種子のバッチについて５０００個体程度スクリーニングする。

（注１）種子の量は、M1植物を育成するスペースや、失敗する可能性も考慮に入れて、数回-10回に分けて変異原処理するのが無難（40 mgを5回など）。必要なM1植物の数については、内藤（蛋白質・核酸・酵素 47, 2002）、酒井・岡田（モデル植物ラボマニュアル, p51, Springer）を参考にする。
（注２）種子が汚いときなどは、滅菌液を1-2回交換する。
（注３）種子発芽の変異体（abi1）などでは4度20時間というプロトコルもあるが、低温室でEMSが揮発しないよう注意する。
（注４）ここではプレートに播くことを考慮し、滅菌水を用いた。EMS処理により、発芽率が１０％程度低下する処理が最適であると言われている。従って、EMS０％で同時に処理を行い、プレートに播いて発芽率をチェックすることが望ましい。最初は、0.1-0.3%の範囲でEMS濃度を検討すると良い。全ての種をプレートに播くと、植え替えが大変なので、通常は一部でよい。発芽率が悪い変異体(lec2など)では、プレートに播種することで発芽率が改善する。