アグロバクテリアによる一過的発現（シロイヌナズナ・タバコ） - motosehiroyasu @ ウィキ

ベンサミタバコ
用意するもの

• 良く育ったNicotiana benthamiana (10cm程度の本葉が３−４枚)
• infiltration buf

　100 mM MES pH=5.7-5.8　　　　　５ｍＬ
　100 mM MgSO4 (MgCl2 でも可)　　５ｍＬ
　500 mM アセトシリンゴン　　　　15 µＬ
　　　　　　　　　　水でtotal ５０ mL

前日
ＬＢ５ｍＬ（葉一枚当たり１ｍＬくらい）にアグロバクテリアを植菌
（p19とGFP fusion ２つ）
当日
infiltration buf に懸濁。OD600 = 0.8（1 以下、濃すぎると葉にダメージ有り）
葉に針で穴をあけ、そこにアグロ懸濁液を吸い取った１ｍＬのプラスティックシリンジをあててゆっくり打ち込む。（手袋着用）
２−３日後に観察、すりつぶし。

シロイヌナズナ
＜準備する物＞

• シロイヌナズナ芽生え（５−７日目、寒天プレートで育成、液体培地でもたぶんＯＫ）
• ＬＢ培地

Tryptone 1 g
Yeast extract 0.5 g
NaCl 1 g
(1N NaＯＨ 0.1 mL)
水を加えてtotal 100 mLにし、オートクレーブ（121℃、15 min）。

• ５％スクロース溶液（各班）

スクロース２．５ｇを水５０ｍＬに溶かし、オートクレーブ（121℃、15 min）。

• ハイグロマイシン、カナマイシン 50 mg/mL
• アセトシリンゴン　200 mM
• １５ｍＬ遠沈管
• 遠心機
• ３０℃の振とう培養機

＜手順＞
１日目
以下の作業はクリーンベンチまたはバーナーの元で行う。

• ＬＢ５ｍＬをとり、５ µLのカナマイシン（50 mg/mL）を加える。pBI-p19のアグロバクテリア（Ａ）を植菌
• ＬＢ５ｍＬに５ µLのハイグロマイシン、カナマイシン（両方50 mg/mL）を加える。pGWB6（GFP N末端fusion用）をもつアグロバクテリア（Ｂ）を植菌
• ３０℃で一晩振とう培養する。

２日目

• ５％スクロース溶液１０ｍＬに１0 µLのアセトシリンゴン（２００ｍＭ）を添加する。
• ＡとＢのアグロを遠心し（４０００ｒｐｍ　５分　室温）、アセトシリンゴンを加えた５％スクロース溶液５ｍＬに両者をまぜて懸濁する。
• シロイヌナズナ芽生えを小型シャーレ（またはマルチウエルプレート）に移し、アグロ懸濁液をひたひたになるまで加える。（２４ウェルプレートの場合、０．５ｍＬ）
• シャーレをデシケーターに移し、減圧を１分かける。これをもう一回繰り返す。
• アグロ懸濁液を除き、水を加える。もう１回減圧する。
• ２−３日培養する。（振とうは必要ない。明所でもＯＫ）

３日目以降

• シロイヌナズナ芽生えをスライドグラスに移し、水を加えてカバーガラスを掛ける。
• 蛍光顕微鏡で観察する（青色480 nm 励起、緑色〜530 nm 観察）。